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第1章 可生物降解脂肪族聚碳酸酯 7
1.1引言 7
1.2 可生物降解脂肪族聚碳酸酯的性质 8
1.2.1 聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)的物理性能[7-8] 8
1.2.2 聚三亚甲基碳酸酯的可生物降解性 8
1.3 可生物降解脂肪族聚碳酸酯的物理、化学改性 9
1.3.1可生物降解脂肪族聚碳酸酯的功能化 9
1.3.2与碳酸酯单体的共聚 9
1.3.3 聚碳酸酯的共混 10
1.4 可生物降解聚碳酸酯的合成 10
1.4.1 环状碳酸酯单体的开环聚合 10
1.4.2 环状碳酸酯单体的合成 11
1.4.3 环状碳酸酯单体开环聚合的引发剂 11
1.5 可生物降解的脂肪族聚碳酸酯在生物医学上的应用 12
1.5.1 作为药物控制释放载体或介质[31-34] 12
1.5.2 作为骨科固定及组织修复材料[35-38] 12
1.5.3 作为外科医用缝合线[39] 12
1.5.4 其它方面 13
1.6 高分子材料用作药物控制释放载体的技术及其分类 13
1.6.1 高分子药物控制释放系统的概述 13
1.6.2 药物控制释放系统的载体 13
1.6.3 药物控制释放系统的优点 14
1.6.4 药物控制释放系统的分类 14
1.6.4.1 扩散控制药物释放体系 14
1.6.4.2 化学控制药物释放体系 15
1.6.4.3 溶剂活化控制药物释放体系 15
1.6.4.4 磁性药物控制释放体系[43] 15
1.7 高分子微球药物控制释放系统的制备方法 16
1.8 肿瘤靶向性给药系统的研究 16
1.8.1 靶向性给药系统的优点及分类 16
1.8.2 叶酸靶向性给药系统的研究 16
1.9 论文研究内容 17
1.9.1 利用两种六元环状碳酸酯单体进行开环聚合反应 17
1.9.2 两亲性聚碳酸酯共聚物的制备及性能研究 17
1.9.3 肿瘤靶向性共聚物载体的制备 17
第2章 实验部分 18
2.1前言 18
2.2 实验部分 20
2.2.1 试剂和仪器 20
2.2.2 碳酸酯共聚物的合成 20
2.2.3 共聚物氢化还原反应 21
2.2.4 氢化还原产物与溴乙酰溴的反应 21
2.2.5 叶酸与乙二胺的反应 21
2.2.6 高分子载体与氨基化叶酸的反应 21
2.2.7 聚合物的体外释药实验 22
2.3 结果与讨论 22
2.3.1 结构表征 22
2.3.2 共聚物的合成 27
2.3.2.1 引发剂种类及单体摩尔投料比对共聚物摩尔质量的影响 27
2.3.2.2 引发剂用量、聚合反应时间和温度对共聚物摩尔质量的影响 28
2.3.2.3 竞聚率的测定 30
2.3.2.4 共聚物热性能的研究 31
2.3.2.5 共聚物亲疏水性的研究 32
2.3.2.6 聚合物的体外释药性能 33
2.4 参考文献 35
第3章 肿瘤靶向性的电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂 37
3.1 引言 37
3.2 电子顺磁共振成像技术 37
3.3电子顺磁共振成像的原理 38
3.4 电子顺磁共振成像的优势 38
3.5 电子顺磁共振成像诊断剂 39
3.6 卟啉和金属卟啉化合物结构特点和功能特性 41
3.6.1 卟啉及金属卟啉类化合物在医学上的应用 41
3.6.2 卟啉类化合物在其它方面的应用 42
3.6.3 金属卟啉化合物作为磁共振成像造影剂的研究 42
3.7 具体研究内容为： 44
第 5 章 46
5.1 前言 46
5.2 实验部分 48
5.2.1 试剂和仪器 48
5.2.2 5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl的合成 48
5.2.2.1 N-Benzylphthalimide的合成 48
5.2.2.2 2-Benzyl-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline 的合成 48
5.2.2.3 5-Bromo-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline合成 49
5.2.2.4 (5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl)的合成 50
5.2.2.5 5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl N-hydroxysuccinimidylester的合成 51
5.2.3 靶向性水溶性磺酸基氨基卟啉的合成 52
5.2.3.1 5-(4-硝基苯)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成 52
5.2.3.2 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成 52
5.2.3.3 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉 53
5.2.4 聚丁二酰亚胺(Polysuccinimide, PSI)生物载体的合成 53
5.2.5 水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子用作肿瘤靶向EPRI诊断剂的制备 54
5.2.5.1 PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉的合成 54
5.2.5.2 PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基的合成 54
5.2.6 PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基与FeCl3的络合反应 55
5.3 结果与讨论 55
5.3.1 结构表征 55
5.3.1.1 水溶性磺酸基卟啉 55
5.3.1.2 5-（4-硝基苯）-10, 15, 20-三苯基卟啉 55
5.3.1.3 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉 55
5.3.1.4 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉 56
5.3.1.5 5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl 58
5.3.1.6 水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子衍生物 59
5.3.1.7 肿瘤靶向性电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂 62
5.3.1.8 聚天冬酰胺衍生物载体的细胞毒性评价 69
5.4 参考文献： 73
摘 要
可生物降解高分子是生物医用材料的重要组成部分，它植入后不需经二次手术取出，在体内不滞留积累，已成为生物医用材料研究中最活跃的领域之一。
可生物降解聚碳酸酯是聚酯高聚物的重要分支，系二元碳酸的相应聚酯，它具有良好的生物相容性，可生物降解性，在手术缝合线，骨固定材料以及药物控制释放系统等领域得到了越来越广泛的应用。本文从结构、合成、性能方面概述了可生物降解聚碳酸酯研究的新进展。
聚碳酸酯是较理想的生物医用材料，可广泛应用于药物控制释放等领域。本文以异丙醇铝及辛酸亚锡为引发剂，利用本体开环聚合的方法，合成了一系列9-苯基-2, 4, 8, 10-四氧螺[5, 5]十一烷-3-酮(PTC)与三亚甲基碳酸酯(TMC)的碳酸酯共聚物，并用催化剂(10%Pd/C)对共聚物进行氢化还原反应，得到部分侧链含羟基的聚碳酸酯，对聚合物进行了FT-IR、1H NMR、UV、GPC、DSC、Water Contact Angle等结构表征。重点研究了单体投料比、反应时间、反应温度、引发剂用量以及引发剂种类对共聚物的影响，测定了两单体的竞聚率，并初步研究了共聚物的体外释药性能和体外降解性能。实验表明，以共聚物为载体的药片具有稳定的释药速率和良好的控制释放性能，还原后的共聚物比还原前具有更好的亲水和体外降解性能，更快的释药速率。
聚天冬酰胺及其衍生物都是可生物降解的水溶性高分子，由于毒性低、无免疫反应、易于化学修饰、在体内可生物降解，且降解产物可被体内吸收等优点，已被用作为血浆扩展剂和药物的载体。本文拟研制肿瘤靶向性卟啉-异氮杂茚自由基型电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂，以水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子用作肿瘤靶向EPRI诊断剂的载体，卟啉衍生物作为肿瘤靶向基团，5-羧酸异氮杂茚自由基作为造影剂。将卟啉衍生物和稳定5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基通过化学反应引入聚天冬酰胺的侧链，从而制备水溶性肿瘤靶向EPRI诊断剂，并对所合成的诊断剂进行FT-IR、1H NMR、UV、DSC等结构表征。水溶性肿瘤靶向EPRI诊断剂的体外细胞毒性实验表明，对于HeLa细胞，诊断剂均表现出较低的细胞毒性，而且诊断剂对肿瘤细胞具有靶向性，是诊断剂更易富集于肿瘤细胞，呈现对肿瘤细胞具有更高的抑制率。
关键词：生物材料、可降生物解高分子、药物控制释放、可生物降解聚碳酸酯。
Abstract
Biodegradable polymer is one of the most attractive biodegradable materials in recent years. Great emphases have been put on medical application of biodegradable polymers, and rapid development has occurred, because they eliminate the need for surgical removal after implantation.
Biodergradable polycarbonate is one of branches of polyesters and it is composed of respective diols and carbonic acid. They have been used in the medical fields, such as suture, bone fixing and drug delivery systems due to their good biocompatibility and biodegradability. In this paper, the trends in the development of biodegradable polycarbonates for medical application have been reviewed and emphasized on their synthesis structuresand properties.
Synthetic polycarbonates are ideal candidates for biomaterials. They are being investigated as biodegradable materials for the wide use in drug delivery systems and a variety of biomedical application. In this paper a series of polymers have been synthesized in bulk using Aluminium-iso-propylate and Sn(Oct)2 as initiators by the bulk ring-opening polymerization with different cyclic carbonates, including 2,2 -(3-phenyl- 2, 4- dioxyl-1, 5-diyl) trimethylene carbonate(PTC) and trimethylene carbonate (TMC). All the copolymers are characterized by FT-IR, NMR, UV, GPC, DSC, Water contact Angle. The influence of monomer/catalyst molar ratio, reaction temperature and time, and different catalysts on the properties of copolymers have been investigated and the reactivity ratio of the comonomers have been determined. In vitro release profiles of 5-Fu from copolymers were also investigated, the results indicated that polycarbonate possessed steady drug release rate. Moerover, partly deprotected copolymers had faster drug ralease rates than those of protected copolymers. In vitro degradation tests showed that partly deprotected copolymers posses the faster degradation rates and more hydrophilicity than the protected copolymers.
第1章 可生物降解脂肪族聚碳酸酯
1.1引言
生物医用材料是指能够对生物体进行诊断、治疗、置换损坏的组织或器官、增进功能的可生物降解高分子材料。可生物降解高分子材料又可分为天然可生物降解高分子和人工合成可生物降解高分子两大类。前者主要有天然多糖[1, 2]、天然多肽[3, 4]等高分子材料，具有良好的生物相容性等优点，但存在来源有限和力学性能较差等缺点，使其在生物医用领域上受到很大的局限性；人工合成的可生物降解高分子与天然可生物降解高分子相比，具有很丰富的来源、可人为的修饰、调控其结构和物理、化学性能的多变性等优点[5-10]。
脂肪族聚碳酸酯是人工合成的一类可生物降解高分子材料，主链上的酯键在自然环境或生物体内，容易受到进攻降解成二氧化碳和中性的二元醇，是聚酯类高聚物的重要分支。脂肪族聚碳酸酯因其具有良好的表面溶蚀性、生物相容性、机械加工性能、可生物降解性以及可生物吸收性，被广泛应用于生物医用材料领域。例如，聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLA)及其它们的共聚物PLGA，均具有良好的可生物降解性和组织相容性，在体内、体外均可水解为相应的a-羟基酸，是最早一类作为生物医用材料应用在医学领域上的可生物降解聚碳酸酯[11-15]。
聚乳酸的代谢产物为乳酸，属生物体内正常代谢物，对生物体无毒且不会在体内造成滞留。因此，聚乳酸作为手术缝合线、骨钉以及药物控制释放载体等生物医用材料，已获得美国FDA的批准[16]。
通常结构的脂肪族聚碳酸酯因分子主链或侧链上不含有亲水性基团，降解速率相对较慢，但在聚碳酸酯的侧链中引入亲水性基团或某些可功能化基团，其亲水性和降解速率将会得到明显提高[17]，而且更有利于药物或靶向性基团的键入，使其在农业、环境、生物医学领域上具有更广阔的应用前景。
1.2 可生物降解脂肪族聚碳酸酯的性质
在医学领域中，脂肪族聚碳酸酯因其良好的生物相容性、表面溶蚀性、可生物降解性和无毒性，已经作为生物医用材料得到越来越广泛的应用。目前，己报道过的许多脂肪族聚碳酸酯的降解速率相对较慢，如聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)的降解速率，比聚乳酸和聚己内酯慢得多。但是，如果在聚碳酸酯侧链上引入亲水性功能基团，其降解速率将会明显提高。
1.2.1 聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)的物理性能[7-8]
聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)是近年来研究较为广泛的一类脂肪族聚碳酸酯，具有良好生物相容性、无毒、较低的玻璃化温度(-20℃左右)、无序或具有少许结晶的可生物降解聚碳酸酯。PTMC的结构式如下所示：
PTMC作为一种可生物降解脂肪族聚碳酸酯，它的物理形态取决于高分子聚合物的分子量。当分子量Mn＜6 000 g/ mol时，PTMC 呈粘稠的油状物；当分子量介于6 000～50 000 g/ mol 时，PTMC 为柔软的塑料，有较好的弹性；当分子量Mn＞50 000 g/ mol 时，其弹性随分子量的增加而增强。PTMC分子链具有较好的柔顺性，它的拉伸应力和弹性模量均比聚己内酯低得多，但它的断裂伸长比却比聚己内酯高得多。由于PTMC具有非常柔顺的机械性能以及独特的可生物降解性，可以通过共聚的手段将PTMC结构单元引入到聚合物的主链中，来改变高分子共聚物的机械性能和生物降解性能。
1.2.2 聚三亚甲基碳酸酯的可生物降解性
PTMC是一类可生物降解的聚碳酸酯，在体内和体外的降解速率呈现明显的差异。PTMC在体外的降解速率比PCL低20倍，但是在体内的降解速率却比PCL高得多。如将PTMC置于磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中，恒温(37℃)条件下，降解30个星期，仅导致9 %的质量损失率和7 %的分子量下降；但将PTMC植入小鼠体内降解26周后，质量损失率和分子量下降分别达到21 %、55 % , 分析其原因，这可能是酶促降解起到了主要作用，使其降解速率明显加快。脂肪族聚碳酸酯(PTMC)不仅具有良好的生物相容性和可生物降解性，而且在体温下具有一定弹性。因此，PTMC作为可生物降解缚扎器件、药物控制释放载体、体内植入和体内支持等生物医用材料，已经在医学领域上得到广泛的应用。
1.3 可生物降解脂肪族聚碳酸酯的物理、化学改性
为了改善聚碳酸酯的物理、化学性能，使其在生物医用材料领域得到更加广泛的应用，通常在高分子聚合物的侧链中引入功能化基团、与其它单体的共聚以及与其它高分子材料的共混等途径来实现。
1.3.1可生物降解脂肪族聚碳酸酯的功能化
可生物降解脂肪族聚碳酸酯作为一类生物医用材料，其功能化基团的修饰是倍受人们关注的研究方向之一。目前，可以通过多种化学方法将氨基、羧基、羟基或巯基引入聚碳酸酯侧链中，例如丙交酯与含有可功能化基团的通过单体本体开环聚合反应，将可功能化的基团引入脂肪族聚碳酸酯的侧链中。作为可生物降解高分子材料，可功能化侧基的引入有利于键合药物、靶向性基团和其它化学修饰，以及改善材料的生物相容性，使聚合物分子链中同时含有亲水性和疏水性链段，形成两亲性聚合物，提高聚合物的亲水性和降解性。可功能化基团的引入改变了聚碳酸酯的化学结构，使聚合物的酯键更容易受到水分子的进攻，从而有效地促进了聚碳酸酯的水解。
1.3.2与碳酸酯单体的共聚
通过改变共聚反应时单体的摩尔投料比或类型，可以人为的调控和修饰聚碳酸酯共聚物的结构和性能，从而合成出适合不同用途的可生物降解聚碳酸酯共聚物，扩大其在生物医学领域上的应用范围。由于酯键的降解速度较快，而碳酸酯得水解速度较慢，因此将两者共聚后可以调节聚合物的降解速率。目前，聚（酯-碳酸酯）是研究较多的一类碳酸酯共聚物。
1.3.3 聚碳酸酯的共混
脂肪族聚碳酸酯与其它可生物降解高分子材料进行共混，可以用来调节聚碳酸酯的物理、化学性能。将不同的可生物降解或可吸收高分子聚合物与脂肪族聚碳酸酯共混，可以获得多样的、性能各异的生物医用材料。
1.4 可生物降解聚碳酸酯的合成
聚碳酸酯一般可由二元醇（酚）与光气进行缩聚、环氧化合物与二氧化碳在有机催化剂作用下的加成反应、环状碳酸酯单体的开环聚合、二元醇与二烷基碳酸酯进行酯交换反应、二元醇直接与二氧化碳或碱金属碳酸酯进行缩聚反应得到。环氧化合物与二氧化碳的加成反应和环状碳酸酯单体的开环聚合，可用来合成高分子量的脂肪族聚碳酸酯[18-20]。但通过环氧化合物与二氧化碳的加成反应，得到的脂肪族聚碳酸酯分子主链中不可避免的存在聚醚链段，因此，环状碳酸酯单体的开环聚合是合成高分子量脂肪族聚碳酸酯的重要途径。
1.4.1 环状碳酸酯单体的开环聚合
环状碳酸酯单体在开环聚合反应过程中，具有热效应低、聚合速度快、在较短的时间内得到高分子量聚合物等优点[21]。因此，开环聚合是制备高分子量脂肪族聚碳酸酯的最主要方法。
根据环状碳酸酯单体环的大小，在聚合反应中一般采用五元或六元的环状碳酸酯单体进行开环聚合，制备脂肪族聚碳酸酯。但五元环状碳酸酯单体，在聚合反应的过程中会出现脱二氧化碳，如碳酸乙烯酯[22]和1, 2-碳酸丙烯酯环状碳酸酯[23]，而二氧化碳的脱去使脂肪族聚碳酸酯分子的主链中存在聚醚链段。因此，一般采用六元环状碳酸酯单体通过开环聚合反应来制备脂肪族聚碳酸酯。
1.4.2 环状碳酸酯单体的合成
六元环碳酸酯单体的合成方法很多，一般采取在低温反应的条件下，以相应的二元醇（如1，3-丙二醇）和氯甲酸乙酯为原料，三乙胺为催化剂，来制备环状碳酸酯单体[24]。此种合成方法所得产物纯度高，产率较高，而且后处理简单，因此，该方法已成为合成六元环状碳酸酯单体最常用的方法。
Scheme 1-1 Synthitic route of the cyclic carbonate
1.4.3 环状碳酸酯单体开环聚合的引发剂
能够引发环状碳酸酯单体进行开环聚合反应的引发剂很多，根据不同的引发剂种类，环状碳酸酯单体又可以按照不同机理进行开环聚合。除聚合机理外，单体的纯度、聚合反应的条件和取代基以及取代基的位置等关键因素对聚合物分子量也有很大的影响[25-28]。
用阳离子引发六元环碳酸酯开环聚合时，反应过程中伴随着脱二氧化碳现象，导致聚合物分子的主链中存在聚醚链段[29]。如采用BF3OEt2、BCl3、BBr3作为催化剂，引发六元环状碳酸酯单体TMC和DTC进行本体开环共聚时，所得到的聚碳酸酯共聚物分子的主链中存在聚醚链段的结构单元[30]。和阳离子开环聚合相比，采用阴离子引发环状碳酸酯单体进行开环聚合时，没有脱二氧化碳现象产生。如利用锡类化合物引发TMC进行本体开环聚合反应时，没有出现脱二氧化碳现象，所得高分子聚合物的摩尔质量为2.5×105g/mol。因此，阴离子引发六元环状碳酸酯单体进行本体开环聚合反应，是目前制备聚碳酸酯的常用方法之一[29-30]。
1.5 可生物降解的脂肪族聚碳酸酯在生物医学上的应用
1.5.1 作为药物控制释放载体或介质[31-34]
可生物降解脂肪族聚碳酸酯作为药物控制释放载体或介质的研究中，根据药物在载体中的载药形式不同，可以将其制备成微球、微粒、微胶囊、膜及片剂等不同形式的药物控制释放体系。
可生物降解高分子用作药物控制释放载体或介质，药物释放完毕后，作为载体的高分子材料不必从活体中取出。并且利用可生物降解高分子材料制备药物缓释胶囊，能有效地拓宽给药途径，可以让药物以一定剂量在一定时间内持续释放，从而使血药浓度保持相对平稳，减小给药剂量和给药频率，最大程度降低药物对肠胃的刺激性，以及减少药物对生物体特别是肝、肾的毒副作用。
1.5.2 作为骨科固定及组织修复材料[35-38]
采用不锈钢作为骨折的内固定材料，需待骨折愈合后进行二次手术取出，不仅增加病人的痛苦，而且延长治疗时间。而采用可生物降解脂肪族聚碳酸酯材料作为骨折的内固定材料，创伤愈合后无需二次手术取出。
聚碳酸酯在作为骨科固定以及组织修复材料领域，包括两个方面的要求，一是要求植入的可生物降解高分子材料在创伤愈合过程中能够缓慢降解，待创伤愈合后不需二次手术取出，这类材料主要用于骨折内固定材料；另一类要求可生物降解高分子材料，在相当长一段时间内缓慢降解，并保持一定的机械性能，通过在材料上培养组织细胞，让其生长成软骨、肝、血管、神经和皮肤等组织或器官，这类材料主要用于组织修复材料。
1.5.3 作为外科医用缝合线[39]
聚乳酸及其共聚物由于具有良好的生物相容性和可生物降解性，通过熔融纺丝或溶液拉丝后，可制作成纤维缝合材料，既能满足缝孔强度要求，又能随创伤愈合而被机体缓慢分解吸收。在创伤愈合后无需二次手术取出，无须拆线，尤其适合深部组织的缝合，因此，聚乳酸及其共聚物可作为外科医用缝合线。
1.5.4 其它方面
可生物降解高分子聚合物微球以其稳定性好、可人为调控化学结构和控制微球粒度大小等优点，可用作基因治疗或药物控制释放载体，通过化学手段控制基因或药物的释放速度。另外，可生物降解高分子聚合物还可用作医用胶粘剂、人造皮肤、纳米药物载体等生物医用材料。
总之，可生物降解聚碳酸酯具有良好的生物相容性和机械加工性能，降解后成为无毒的中性物质，而且通过功能化、共聚或共混可以调节聚碳酸酯的结构和性能，以满足不同的需要。因此，可生物降解聚碳酸酯在生物医用领域必将具有更广阔的应用前景。
1.6 高分子材料用作药物控制释放载体的技术及其分类
1.6.1 高分子药物控制释放系统的概述
高分子药物控制释放体系，是利用天然或人工合成的高分子材料作为药物的载体或介质，制成一定的剂型，然后置于释放的环境中。控制药物在环境中的释放速度，使药物按设计的剂量，在要求的时间内，以一定的速度，通过扩散或其它途径在生物体内缓慢释放，从而达到治疗疾病的目的[40]。
1.6.2 药物控制释放系统的载体
用作药物控制释放载体的高分子材料，分为可生物降解型和非生物降解型两大类。非生物降解型体系一般采用聚氨酯弹性体、乙烯与醋酸乙烯共聚物等高分子材料。对药物控制释放体系来说，可生物降解型高分子优于非生物降解型。目前，脂肪族聚碳酸酯类是应用较为广泛的可生物降解型高分子材料。
1.6.3 药物控制释放系统的优点
随着现代医学的发展，高分子材料被广泛应用于生物医用材料领域，作为药物控制释放的载体是最热门的方向之一。低分子药物虽然疗效高，使用方便，但同时有些药物对生物体存在着很大的毒副作用。一般低分子药物都是通过口服或注射进入，在短时间内，血液中药物的浓度远远高于治疗所需的浓度，过高的浓度可能会导致中毒、过敏等症状。同时，由于它们在生物体内新陈代谢速度快，半衰期短，易排泄，随着时间的推延，药物的浓度降低很快而影响治疗效果。另一方面，进入人体内的低分子药物对指定部位缺乏选择性，这也是给药剂量增多，疗效较差的原因之一。与低分子药物相比，以高分子材料为载体的药物控制释放体系，具有长效、高效、低毒、缓释、选择性好、毒副作用小等优点。因此，作为药物控制释放载体的高分子材料在医学上的研究和应用日益受到人们的重视。
1.6.4 药物控制释放系统的分类
药物控制释放系统的分类有很多种，按释药机理分可分为扩散机理、化学反应机理、溶剂活化体系和磁性药物控制释放体系四大类。
1.6.4.1 扩散控制药物释放体系
扩散控制药物释放体系可分为储藏型和基质型两种。前者是将药物包埋在聚合物载体中，然后从聚合物体系中扩散释放到环境中。该类控制释放体系通常是将高分子材料制成平面、球型、圆筒等载体形式，药物包埋在其中，且随时间变化呈恒速释放[41]。在基质型释放体系中，药物是以溶解或分散的形式与聚合物载体结合在一起的。对于以非生物降解型高分子材料作为载体的药物控制释放体系，药物在体系中的溶解性是其释放速率的控制因子。对于可生物降解型高分子材料，药物的释放速率既受药物在体系中溶解性的控制，也受到高分子载体降解速度的控制。如果降解速度远低于扩散速度，扩散成为药物释放的控制因素；反之，如果药物在载体中难以移动，则降解成为释放的控制因素。
1.6.4.2 化学控制药物释放体系
化学控制药物释放体系可分为两种药物体系，即混合药膜可生物降解体系和可生物降解大分子药物体系。在混合药膜体系中，药物分散在可生物降解高分子材料中，药物在高分子载体中难以扩散，只有在外层高分子降解后药物才能从载体中释放出来。在可生物降解大分子药物体系中，药物与高分子载体或药物分子之间是以化学键的形式相连，药物的释放必须通过水解或酶解来进行。
1.6.4.3 溶剂活化控制药物释放体系
聚合物作为药物控制释放载体，是通过渗透和溶胀机理来控制药物以一定的速率的释放。前者是运用半透膜的渗透原理，药物释放的速率与药物的溶解度有关，而与药物的其它性质无关；后者是通过聚合物的溶胀来控制药物的释放速率，药物通常被溶解或分散在聚合物载体中，开始时药物并不扩散，而当溶剂渗透到聚合物后，聚合物开始溶胀，高分子链松弛，药物才从聚合物载体中扩散出去[42]。因此，这种药物控制释放体系的载体，要求是可以溶胀的高分子材料。如EVA, PVA等。
1.6.4.4 磁性药物控制释放体系[43]
磁性药物控制释放系统由分散在高分子载体骨架中的药物和磁粒组成，药物释放的速率由外界振动磁场控制。在外磁场的作用下，磁粒在高分子载体骨架内移动，从而带动磁粒附近的药物一起移动，使药物从控制释放体系中释放出来。因此，高分子载体骨架和外磁场是影响该体系药物释放速率的主导因素。
按给药途径高分子药物控制释放系统可分为经皮渗透系统、口服系统、植入系统和注射系统等；按形态结构可分为微球、微囊等。
1.7 高分子微球药物控制释放系统的制备方法
为了避免采用外科手术进行植入，使用具有可注射性、可生物降解性和具有良好生物相容性的高分子微球，已成为控制释放制剂的主要形式。高分子微球的制备方法根据高分子聚合物的性质、药物的性质以及临床来确定。用于制备高分子微球的方法可分为单乳法、双乳法、相分离法、喷干法、溶液增强分散法、热融法、熔融乳化法等。
1.8 肿瘤靶向性给药系统的研究
癌症是当今威胁人类健康的头号顽症，但常用的抗肿瘤药物普遍存在水溶性差以及毒副作用大等缺点，极大的限制其在临床上的使用。因此，设计高效率、多功能、低毒的抗癌药物，希望它们能够对病灶器官、组织以及细胞具有专一的识别功能，即靶向性。
1.8.1 靶向性给药系统的优点及分类
靶向性给药系统不仅能将抗肿瘤药物制成一定的剂型，而且还能将药物定向输送至病变区域或组织，减少药物在正常组织中的分布，提高治疗效果，减少药物剂量，降低毒副作用。靶向给药系统按照其原理，一般可分为脂质体靶向给药、受体靶向给药、微粒靶向给药三大类。
1.8.2 叶酸靶向性给药系统的研究
研究表明，叶酸受体在许多恶性肿瘤细胞膜表面均有过度表达，如卵巢、宫颈、子宫内膜、肾、乳腺、脑、肺和结肠癌等，而在正常组织或细胞中的表达仅限于难于进入血液循环的上皮细胞顶膜。利用叶酸对叶酸受体具有高度亲和性这一特性，可将叶酸作为抗肿瘤药物的靶向配体，从而实现抗肿瘤药物的靶向输送日益引起了人们的重视[44-46]。
1.9 论文研究内容
1.9.1 利用两种六元环状碳酸酯单体进行开环聚合反应
以三亚甲基碳酸酯(TMC)与9-苯基-2, 4, 8, 10-四氧螺[5, 5]十一烷-3-酮(PTC)两种六元环碳酸酯为单体、辛酸亚锡和异丙醇铝为引发剂，经本体开环聚合制备三亚甲基碳酸酯-碳酸酯共聚物P(TMC-co-PTC)，对共聚物的结构和性能进行了1H NMR、GPC、DSC、Automatic Contact Angle Meter，FT-IR, UV等表征，并研究了单体摩尔投料比、引发剂种类和用量、反应时间和反应温度等关键因素对共聚反应的影响，以及对共聚物的释药性能和体外降解性能进行了初步的研究。
1.9.2 两亲性聚碳酸酯共聚物的制备及性能研究
以10% Pd/C为催化剂，对制备的P(TMC-co-PTC)共聚物进行氢化还原脱保护，得到部分侧链含羟基的两亲性聚碳酸酯共聚物。由于羟基的引入，实现了对可生物降解聚碳酸酯的功能化，使共聚物侧链中含有部分亲水性基团（羟基），并对两亲性共聚物的结构和性能进行了1H NMR、GPC、DSC、Automatic Contact Angle Meter、FT-IR、UV等表征，以及体外释药性能和降解性能的测试。
1.9.3 肿瘤靶向性共聚物载体的制备
以氢化还原后的两亲性聚碳酸酯共聚物为原料，经溴代反应后将氨基化叶酸接入聚合物侧链，得到部分侧链含肿瘤靶向性基团（叶酸）的共聚物载体，并对所得化合物进行1H NMR、FT-IR、UV等结构表征。
第2章 实验部分
2.1前言
脂肪族聚碳酸酯由于具有良好的生物相容性、表面溶蚀性，作为生物医用材料在医学领域中得到越来越广泛的应用。
环状碳酸酯的开环聚合在合成聚碳酸酯方面具有许多突出的优点，如在聚合过程中热效应低、聚合速度快、能在短时间内达到很高分子量，是合成脂肪族聚碳酸酯的最常用的方法。根据环的大小，一般有五、六、七元环以及极少数大环。由于五元环碳酸酯开环聚合时，总是有脱二氧化碳现象产生。因此，一般采用六元环或更大的环状碳酸酯单体，通过开环聚制备较高分子量的聚碳酸酯。迄今报道的许多脂肪族聚碳酸酯的降解速率相对较慢，如果在聚碳酸酯的侧链上引入亲水性功能基团，其降解速率将会明显提高，而且有利于药物的键接与进一步的化学改性。
本文将PTC (2-phenyl-5, 5-bis (hydroxymethyl) trimethylene carbonate)与TMC (trimethylene carbonate)分别以辛酸亚锡或异丙醇铝为引发剂进行了开环共聚反应，将所得化学物用10%Pd/C进行氢化还原反应，制备部分侧链含亲水性基团（羟基）的聚碳酸酯共聚物。羟基的引入，不仅增加了共聚物的亲水性，而且有利于肿瘤靶向基团药物前体进行化学键合或其它化学修饰。对共聚物的结构和性能进行了1H NMR、GPC、FT-IR、UV等表征，研究了开环共聚时两单体的竞聚率，并对聚合物进行了体外释药性能和降解性能的研究。具体合成路线如下：
Scheme 2-1 Synthetic route of polycarbonate P(PTC-co-TMC)
Scheme 2-2 Synthetic route of polycarbonate containing hydroxyl groups
Scheme 2-3 Synthetic route of copolymers with target groups
2.2 实验部分
2.2.1 试剂和仪器
TMC的制备参见文献[5-6]，PTC的制备及表征参见文献[1]，其它试剂均为分析纯，用前纯化。1H NMR谱用300MHz Varian Mercury VX-300型核磁共振波谱仪测定，TMS为内标。聚合物分子量及其分布在配备2695D分离组件的Waters高压液相色谱仪上测定，色谱柱由HR3、HR4和HT5组成，以聚苯乙烯为标样，DMF为流动相，流速为1 mL/min。检测响应由Waters 2414检测器收集处理，柱温35℃，检测器温度40℃。FT-IR用TJ270型傅里叶红外光谱仪测定，KBr压片，UV用北京谱析紫外可见分光光度计测定。
2.2.2 碳酸酯共聚物的合成
该共聚物由两种六元环状碳酸酯单体(TMC和PTC)在真空条件下，以异丙醇铝（或辛酸亚锡）为引发剂经本体开环聚合制备。 取TMC和PTC摩尔总量为0.01 mol、100μL异丙醇铝或辛酸亚锡的无水甲苯溶液(0.l mol/L)，依次加入带磁子的彻底干燥的聚合瓶中，然后减压除去溶剂，再通氩气，如此反复几次，最后将真空密封的聚合瓶在恒温条件(180 ℃)下。反应24 h后，用适量的二氯甲烷溶解产物，过量的乙醇/正己烷(v/v=1:1)重沉淀，过滤后真空干燥得白色固体。
2.2.3 共聚物氢化还原反应
将0.68g P(PTC-co-TMC)的共聚物（聚合反应时单体摩尔投料比为TMC/PTC=1:4, 1:1, 4:1, 引发剂为辛酸亚锡）溶于10mL的DMF与甲醇的混合溶液中(5:1, v/v)，加入0.102g 10%Pd/C，在常压条件下通入氢气，于60℃油浴下反应96h，抽虑得澄清滤液，蒸干溶剂，再用少量二氯甲烷溶解，乙醇/正己烷(v/v=1:1)重沉淀，所得固体在40℃下真空干燥到恒重。
2.2.4 氢化还原产物与溴乙酰溴的反应
称取氢化还原产物，加入适量无水二氯甲烷溶解后倒入烧瓶中。加入BrCH2COBr，在冰水浴条件下逐滴滴加吡啶，室温下搅拌反应24h, 反应瓶底有白色固体不溶物，抽虑除去不溶物，滤液用正己烷沉淀，沉淀为黄色，用乙醚洗涤沉淀物，真空干燥。
2.2.5 叶酸与乙二胺的反应
称取叶酸置于烧瓶中加入DMSO溶解，将烧瓶置于油浴中在50℃恒温待叶酸完全溶解。加入DCC，NHS恒温反应6h, 再加入EDA，吡啶在25℃恒温反应5h。反应液过滤掉杂质，用乙醇沉淀，抽滤，用乙醇洗涤所得固体，多次沉淀干燥保存，所得固体产物为红褐色。
2.2.6 高分子载体与氨基化叶酸的反应
将溴带的聚合物用DMSO溶解，称取叶酸-CH2CH2NH2用DMSO溶解倒入烧瓶中。加入三乙胺，在40℃条件下反应4h后，将抽滤所得滤液滴入冷蒸溜水中得鹅黄色沉淀。将沉淀用二氯甲烷充分溶解，溶液为红褐色，发现有少许不溶物，过滤，溶缩滤液。再用少量的二氯甲烷溶解，用无水乙醇沉淀析出红褐色固体，过滤，干燥。
2.2.7 聚合物的体外释药实验
取10 mg抗癌药物5-氟尿嘧啶及100 mg共聚物溶于四氢呋喃中，将该溶液置于表面皿中，让溶剂自然挥发，将所得固体压成片，置于装有少量PBS缓冲溶液的透析袋中。然后将此透析袋置于盛有100 mL 0.1 mol/L的PBS缓冲溶液(pH=7.4)的锥形瓶中，将其置于37 ℃恒温振荡器中振荡。 每隔一段时间从瓶中取出25 mL溶液，并补加25 mL PBS缓冲溶液。用紫外光谱仪测定所取溶液在265 nm下的吸光度，作释放率随时间的变化曲线。
工作曲线可通过如下方法测定：根据朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律，配制吸光度在1.4以下一系列浓度的5-氟尿嘧啶的PBS溶液，然后分别在265 nm以PBS溶液为参比，分别测定相应的吸光度值(A)。 将测定结果用吸光度值(A)对浓度(C)作图，即可得到工作曲线： C = 0.7691*A + 0.0017(C的单位为10-4mol/L)。
2.3 结果与讨论
2.3.1 结构表征
该碳酸酯共聚物以异丙醇铝或辛酸亚锡作引发剂，采用本体开环聚合反应制备，所得共聚物溶于CH2Cl2、CHCl3等有机溶剂，不溶于乙醚、正已烷、乙醇等溶剂。 共聚物经FT-IR、UV、1H NMR结构表征，分析如下：FT-IR (KBr, cm-1): 3047.2 (C-H), 2970, 2865 (-CH2), 1750 (C=O), 1458 (C-C), 237.26, 1101.86 (C-O-C=O); UV (CH2Cl2, nm): 221, 256, 261 (C6H5-); 1H NMR (CDCl3, ppm)δ: 7.253-7.453 (C6H5-), 5.436 (C6H5-CH), 4.552 (-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 4.225 (-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 4.012 (-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 3.885 (-COO-CH2-CH2-CH2-), 2.035 (-CH2-CH2-CH2-)。
Figure 2-1 1H NMR spectrum of P(TMC-co-PTC) copolymers in CDCl3
Figure 2-2 UV spectrum of P(TMC-co-PTC) copolymers in CH2Cl2
红外光谱结果表明，1751.86cm-1处的尖锐吸收峰为碳酸酯中羰基(-OCO-)的伸缩振动吸收峰，说明共聚产物中存在碳酸酯的结构片段；紫外光谱结果表明，256nm, 261nm处吸收峰属于苯环的特征吸收峰，说明碳酸酯共聚物中存在含苯基的结构片段；1H NMR图谱结果分析，7.253-7.453ppm处三重峰为PPTC重复结构单元中苯环上的吸收蜂，2.035ppm为PTMC重复结构单元中亚甲基(-CH2-CH2-CH2-)的吸收峰，并且可以根据氢的吸收峰面积之比计算出共聚物中PPTC与PTMC重复结构单元之比。由红外、紫外、核磁图谱可知，碳酸酯共聚产物是由PPTC重复结构单元和PTMC重复结构单元组成。
Figure 2-3 1H NMR spectrum of partly deprotected copolymers in CDCl3
共聚物经氢化还原反应后，得到部分侧链含亲水性基团（羟基）的共聚物。还原后的共聚产物经FT-IR、UV、1H NMR结构表征，分析如下：FT-IR (KBr, cm-1): 3450 (-OH), 2970, 2865 (-CH2), 1750 (C=O), 1458 (C-C), 237.26, 1101.86 (C-O-C=O); UV (CH2Cl2, nm): 256, 261 (C6H5-); 1H NMR (CDCl3, ppm)δ: 7.253-7.453 (C6H5-), 5.436 (-C6H5-CH-), 4.619(-CH2-OH), 4.552 (-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 4.225(-COO-CH2-C(CH2O-)2-), 4.012(-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 3.885(-COO-CH2-CH2-CH2-), 3.72-3.81(-CH2), 2.035(-CH2-CH2-CH2-)。
红外图谱结果表明，3450cm-1处出现的强吸收峰为还原后共聚物侧链中羟基的吸收峰。1H NMR图谱结果分析，3.72-3.81ppm处出现的多重峰属于与羟基相连的亚甲基质子峰，4.619ppm处出现的吸收峰为羟基质子峰。通过共聚物还原前后碳酸酯结构片段含量的变化计算出共聚物被还原脱保护的比例。
Figure 2-4 FT-IR spectrum of the functional copolymers
Figure 2-5 UV spectrum of P(TMC-co-PTC) copolymers in CH2Cl2
Figure 2-6 1H NMR spectrum of the functional copolymers in DMSO
还原后碳酸酯共聚物与溴乙酰溴反应，得到部分羟基被溴代的共聚物，再与氨基化叶酸反应得到侧链含肿瘤靶向性基团的共聚物载体。含叶酸基团共聚物载体经FT-IR、UV、1H NMR结构表征，分析如下：FT-IR (KBr, cm-1): 3480 (-OH), 3350 (-NH2), 2960, 2860 (-CH2), 1750 (C=O), 1641 (C=N), 1458(C-C), 237.26, 1101.86 (C-O-C=O); UV (CH2Cl2, cm-1): 227, 286, 365, 476; 1H NMR (CDCl3, ppm) δ: 8.0 (-CONH-), 7.9 (-NH-C6H5-CO-), 7.3-7.4 (C6H5-), 5.436 (-C6H5-CH-), 5.1 (-N=C-OH), 4.49 (-NH-CH-COOH), 4.45 (-CH2-NH-), 4.39 (-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 4.3 (-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 4.27 (-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-), 4.13 (-COO-CH2-CH2-CH2-), 3.0 (-NH-CH2-CH2-NH2), 2.89 (-CH2-CH2-NH2), 2.7 (-CH2-CONH-), 2.55(-C-CH2-)。
红外图谱结果表明，1641cm-1处出现的吸收峰属于叶酸分子中酰胺键的吸收峰，1607-1529cm-1处出现的多峰归属于叶酸分子中碟氮环上的吸收峰；紫外图谱结果表明，476, 365, 286, 227nm处出现的吸收峰为叶酸分子的特征吸收峰；1H NMR图谱中，7.9ppm是叶酸分子中苯基的吸收峰，5.1ppm叶酸碟氮环上羟基的吸收峰，7.4ppm是碳酸酯结构片断中苯基的吸收峰。结合红外、紫外图谱、核磁图谱表明共聚物侧链中已成功接入了肿瘤靶向性基团。
2.3.2 共聚物的合成
Lewis酸如Sn(Oct)2以及烷氧基金属化合物如Al(OiPr)3 都能很好的引发环状碳酸酯的开环聚合，而且价廉易得，是常用的引发剂。 本文在以上两种催化剂条件下，重点研究了单体摩尔投料比、引发剂的种类、引发剂的用量以及反应时间和温度对聚合物分子量的影响。
2.3.2.1 引发剂种类及单体摩尔投料比对共聚物摩尔质量的影响
在保持反应温度(180℃)、反应时间(24 h)和引发剂种类以及引发剂用量不变的条件下，研究引发剂种类和单体摩尔投料比对共聚物分子量的影响，见Table 2-1。
Table 2-1实验结果表明，在其它反应因素相同时，以异丙醇铝为引发剂所得到的共聚物分子量比辛酸亚锡高。说明在本实验条件下，异丙醇铝比辛酸亚锡能更好的引发单体发生聚合反应。同时，单体TMC摩尔质量的变化对共聚物摩尔质量的影响很大，共聚物的分子量逐步上升，当TMC: PTC=8:1时，聚合物数均分子量可达33250 g/mol。这可能是因为，随单体摩尔投料比([TMC]/[PTC])增大，共聚物中PTMC链段含量增大，共聚物组成摩尔比([PTMC]/[PPTC])大于单体摩尔投料比，单体TMC的反应活性大于PTC，故随着TMC含量的增大分子量呈上升趋势。
Table 2-1 Effect of initiator on the molecular weight of copolymer
Entry TMC/PTC a [PTMC/PPTC]b Mnc Mnd Mw/Mne Mw/Mnf
1 0.125: 1 0.202 22112 15699 1.111 1.088
2 0.25: 1 0.342 23034 16780 1.121 1.086
3 0.5: 1 0.404 28594 17200 1.147 1.108
4 1:1 0.57 29870 18265 1.199 1.108
5 2:1 0.702 30000 20400 1.135 1.096
6 4:1 0.831 32290 22353 1.181 1.176
7 8:1 0.909 33250 26600 1.132 1.204
2.3.2.2 引发剂用量、聚合反应时间和温度对共聚物摩尔质量的影响
在保持单体的摩尔总量(0.01mol)，单体TMC和PTC的摩尔投料比(0.5: 1)，引发剂浓度(1‰)和Al(OiPr)3 为引发剂不变的条件下，研究引发剂用量、反应时间和反应温度对聚合物分子量的影响，见Table 2-2。
引发剂Al(OiPr)3用量对碳酸酯共聚物分子量的影响见Table 2-2，实验结果表明随着引发剂用量的增加，聚合物分子量变化呈现先上升后下降的趋势，所得聚合物数均分子量介于13722-28594 g/mol之间。
在反应时间为24h, 反应温度180℃，[M]/[I]=1000时得到的共聚物分子量最大。共聚物分子量随着反应时间的增加先升高后降低，这可能是因为反应时间过短，聚合反应不完全；反应时间过长，又可能引起聚合物的降解。
在研究聚合反应温度对共聚物分子量的影响时，选取了4个不同的反应温度(170℃、180℃、190℃、200℃)进行聚合反应。实验结果表明，聚合物分子量随着聚合反应温度的升高而增加 。但反应温度超过180 ℃后，所得聚合物分子量有所下降, 当聚合温度达到200 ℃时，聚合物分子量迅速下降到9839g/mol, 这可能是因为在聚合反应中适当升高聚合反应温度有利于得到较高分子量的聚合物。聚合反应温度过低，可能导致反应不发生或反应不完全；而聚合反应温度过高，又有可能引起聚合物发生热降解或酯交换反应。
Table 2-2 Ring-Opening Copolymerization of TMC-co-PTC with Sn(Oct)2 or Al(OiPr)3 as Initiator
Entry TMC/PTCa [M]/[I]b Time(h) Temp(℃) Mnc Mw/Mn
1 0.5:1 250 24 180 13722 1.213
2 0.5:1 500 24 180 16074 1.242
3 0.5:1 1000 24 180 28594 1.147
4 0.5:1 2000 24 180 21581 1.189
5 0.5:1 1000 6 180 18752 1.227
6 0.5:1 1000 12 180 20263 1.204
7 0.5:1 1000 36 180 19681 1.177
8 0.5:1 1000 48 180 13061 1.317
9 0.5:1 1000 24 170 18525 1.252
10 0.5:1 1000 24 190 11142 1.188
11 0.5:1 1000 24 200 9839 1.312
2.3.2.3 竞聚率的测定
两种六元环状碳酸酯单体TMC与PTC进行开环共聚反应时，单体的反应活性可以用竞聚率来表示。竞聚率r1和r2是指单体聚合时均聚和共聚链增长速率常数之比，表示两单体的相对活性。
在聚合反应时，保持反应温度、反应时间、引发剂用量不变的条件下，通过改变单体的摩尔投料比，来测定量单体的反应相对活性。 由1H NMR谱测定聚合物中两链段的含量之比d[PTC] /d[TMC]，以聚合物组成F1= d[PTC]/(d[TMC]+d[PTC])对单体摩尔投料比f1=[ PTC]/([TMC]+[PTC])作图，如Figure 2-1，并根据方程f1=1- f2, F1=( r1 f12+ f1f2)/( r1f12+2f1f2+ r2f22), 求出r1和r2 。
Figure 2-1 Plot of F versus f for TMC-PTC copolymers of variable composition.
测得r1 = 1.24, r2=0.57, r1*r2 =0.71<1, 为非理想共聚。说明在开环聚合反应时，活性末端TMC*与活性末端PTC*相比，具有更大的与单体分子反应的活性；且TMC*加上一个TMC单元的几率大于加上一个PTC单元。这可能是因为PTC单体中含有苯基，在聚合时苯基的存在导致位阻效应增加，使PTC单体活性末端共聚倾向大于自聚。
2.3.2.4 共聚物热性能的研究
在聚合反应时，保持反应温度、反应时间、引发剂用量不变，通过改变单体的摩尔投料比来进行本体开环聚合反应，研究单体投料比以及氢化还原反应对共聚物热力学性能的影响。
Table 2-3 Effect of monomer feed ratio on the glass transition temperature of protected and deprotected copolymers
Entry TMC/PTC a Tg(℃) Tg(℃)
(P(TMC-co-PTC) (P(TMC-co-PTC-HTC)
1 1:0 73.2
2 0.125: 1 69.6
3 0.25: 1 67.4
4 0.5: 1 62.4 42.2
5 1:1 54 39.1
6 2:1 33.7 17.3
7 4:1 10.2
8 8:1 -7.2
9 0:1 -23.6
Figure 2-2 DSC thermograms of the copolymer
Figure 2-2 实验结果表明，共聚物玻璃化转变温度随着单体摩尔投料比(TMC/PTC)的增加，呈现下降的趋势。从分子结构上分析，这可能是因为单体PTC中含有刚性基团（苯环），可使共聚物分子侧链刚性增强。随着共聚物中PPTC重复结构单元含量的增加，聚合物分子链的刚性增强，故玻璃化转变温度随着单体摩尔投料比(TMC/PTC)的增加而降低。由Table 2-3可知，碳酸酯共聚物氢化还原脱保护后玻璃化转变温度比还原前低，这可能是因为共聚物经氢化还原反应后，部分PPTC重复结构单元脱去苯基，使其聚合物分子侧链的刚性减弱，故还原后共聚物玻璃化转变温度降低。
2.3.2.5 共聚物亲疏水性的研究
Table 2-4 Effect of monomer feed ratio on the contact angle degree of protected and deprotected copolymers
Entry TMC/PTC a WCA(° ) WCA(° )
(P(TMC-co-PTC) (P(TMC-co-PTC-HTC)
1 0.125: 1 87.21
2 0.25: 1 85.66
3 0.5: 1 80.85 75.02
4 1:1 72.26 64.48
5 2:1 70.3 65.03
6 4:1 65.37
7 8:1 64.35
Figure 2-2 Plot of WCA versus variable composition of the copolymer
Figure 2-2 实验结果表明，共聚物水接触角随着单体摩尔投料比(TMC/PTC)的增加，呈现下降的趋势。这可能是因为单体PTC中含有苯环，随着其含量的增加，碳酸酯共聚物疏水性增强，故接触角随着单体摩尔投料比(TMC/PTC)的增加而降低。由Table 2-4可知，对于同一单体摩尔投料比共聚物，进行氢化还原脱保护后其水接触角降低，这可能是因为部分PPTC重复结构单元脱去苯基，使碳酸酯共聚物分子链的亲水性增强，故还原后共聚物接触角降低。
2.3.2.6 共聚物氢化还原反应
Table Experimental data comparison of protected/deprotected P(TMC-co-PTC) with different feed molar of TMC/PTC
Feed molar Repeat unit Contact Glass
ration of TMC/PTC angle transition
monomer in Mn Mn/Mw (degree) temperature
TMC/PTC copolymer (Tg)(℃)
(mol/mol) (mol/mol)
4：1
2：1
1：1
1：2
1：4
2.3.2.6 聚合物的体外释药性能
选取由不同单体摩尔投料比(TMC/PTC=1:4, 1:1, 4:1)聚合制备的三种碳酸酯共聚物，与5-氟尿嘧啶混合制备以共聚物作为载体的药物控制释放体系。体系中药物的释放速率受到药物溶解度、扩散速度以及高分子载体的降解速率等因素的控制和影响。利用5-氟尿嘧啶的PBS缓冲溶液(pH=7.4)，在紫外光谱265nm处有特征吸收峰，而高分子载体在这一区域没有特征吸收，采用紫外光谱来测定5-氟尿嘧啶的释放速率，测得的吸光度可由工作曲线(C=0.7691*A+0.0017)转化为药物的浓度，从而求出控制释放体系中药物的累积释放率随时间变化的关系，如Figure 2-3所示。
Figure 2-3 The release profile of 5-Fu from the copolycarbonate
(Polymerization condition: Monomers(PTC: TMC=1:2、PTC: TMC=2: 1), M/I(molar ratio) =1000 initiator: Al(OiPr)3, temp: 180℃,time:24h )
Figure 2-3 实验结果表明，以本体开环聚合反应制备的碳酸酯共聚物，作为药物控制释放的载体，药物从体系中释放时无明显的暴释现象，在初始阶段药物的释放速率较快，但随着时间的增加，释药速率逐渐趋于平稳。体系经过100天的释放后，以共聚物P(PTC-co-TMC) ([PTC]:[TMC]=4:1)为载体的药物控制释放体系高于P(PTC-co-TMC) ([PTC]:[TMC]=1:1)和P(PTC-co-TMC)([PTC]:[TMC]=1:4)共聚物体系，三者分别达到62%、52%和39%。这可能是因为PTC结构链段中含有呈刚性的苄氧基，使共聚物分子链的位阻效应增加，分子链缠绕疏松，而且随着共聚物中PPTC重复结构单元的增加，分子链的位阻效应越明显，缠绕越疏松，从而越有利于药物从控制释放体系中释放出来。同时，共聚物的分子量也会影响药物的释放速率，分子量越高，共聚物降解速率越慢，不利于药物的释放。对这些影响药物释放速率因素的研究，为下一步制备侧链含有亲水性功能基团，以及具有较快、稳定的释药速率的碳酸酯共聚物载体提供了一定的基础。
2.4 参考文献
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第3章 肿瘤靶向性的电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂
3.1 引言
肿瘤，尤其是恶性肿瘤已成为危害人类健康和生命的最主要疾病之一，现代医学尚不足以控制癌症对人类生命的威胁。据全国肿瘤防治研究办公室提供的《中国人口死因最新排行表》表明，癌症死亡率居各种死因第二位。全世界每年死于癌症的约有700万人之多，中国就占约100万人。据卫生部统计，近几年中国每年新增癌症病人200万人，死亡130多万人，目前全国癌症患者总数约为450万人左右，其中肝癌患者较多，而且癌症发病率有进一步上升的趋势。
医学研究表明，由由基是引发癌症疾病的罪魁祸首。人类生活的变化，例如不良生活习惯如吸烟、酗酒、饮食结构不合理，以及环境污染等产生大量自由基（如活性氧自由基，超氧阴离子自由基、羟基自由基、酯氧自由基等）在体内积累，打破人体自由基产生和清除之间的动态平衡。过剩的自由基导致细胞损伤，甚至破坏细胞内的DNA，启动了致癌基因或封闭了抑癌基因，产生大量异常DNA，导致癌症的产生。因此，如何检测体内自由基、治疗癌症、进一步研究自由基致癌机理已成为国际上亟待解决的前沿课题之一[1]。
近年来，电子顺磁共振成像(ESRI)技术在生物医学领域中获得了较多的应用[2-5]。利用ESRI 技术，可以有效地获得生物体内与顺磁性物质（如自由基）相关的生理、病理变化情况，还可获得某些药物在体内或特定组织中的吸收与代谢规律的信息。
3.2 电子顺磁共振成像技术
在基础科学和应用科学领域中，电子顺磁共振(EPR)是检测含有未偶电子的顺磁性物质（如自由基、过渡金属离子等）的一种重要方法。随着人们对自由基在生物医学领域的深入研究，不仅需要了解各种生物活性自由基的性质与产额，而且还希望了解自由基等顺磁性物质在生物体内特定组织、器官或在生物体内的空间分布情况，以及它们在生物体内代谢过程中不同区域的浓度差异。尤其是当生物体处于某种病理状态时，获取上述信息，更有实际意义。例如，可以揭示某些与自由基相关疾病的发生与发展规律；通过观察某些顺磁性化合物在体内的动态分布特征；还可以获得有关药效、药代的重要信息。所以，近年来顺磁共振成像(EPRImaging，EPRI)方法被广泛应用到生物医学研究的许多方面，对生物体内活性顺磁物质的在体检测及多维成像分析，已成为当前新的研究热点。
3.3电子顺磁共振成像的原理
电子顺磁共振(Electron Paramagnetic (Spin) Resonance, EPR or ESR)是一种检测和分析生物体内自由基的最有效手段。近年来，电子顺磁共振成像(EPR Imaging, EPRI)，作为对生物体内活性顺磁物质如自由基在体内检测及多维成像分析的方法，现广泛应用于对动物的多种组织或器官，如肿瘤、心、脑、肝脏、肾、胃、以及腹腔、胸腔等进行成像检测[6-8]。
电子在原子或分子中大多数都是以配对形式存在的，这样可以抵消它们内在的磁性质。若电子以不配对的形式存在时，它们能够与外界磁场间有较弱的耦合作用，这就是顺磁共振的基本原理。不论是核磁共振还是电子顺磁共振都是按照这一原理工作的，核磁共振成像是利用了原子核的磁矩与磁场间的耦合，即顺磁分子的核磁矩在按磁场方向进行排列时，吸收并辐射微波波段的电磁波，借助于调控磁场的大小来改变在给定空间内电磁波的强度，从而重构出该空间内的三维图像。
3.4 电子顺磁共振成像的优势
电子顺磁共振(EPR)成像是一种重构物质内部未偶电子自旋密度分布的技术，它与已获得广泛应用（尤其在医学上）的NMR成像相似。与核磁共振成像(MRI)及X线CT相比，在电子顺磁共振成像诊断剂(EPR Imaging Contrast Agent)的增强作用下，EPRI对癌症检测具有以下优势[9-10]：
(1) 体内自由基往往直接参与生物体的某些生理或病理过程，在癌症的发生与发展中起主要作用，所以EPRI不仅仅是结构性成像，而且是直接对癌症致病因子的无损成像检测分析，可以揭示癌症发生与发展规律。
(2) EPRI有更好的分辨率，产生成像信号的物质及所获得的信息也将更多。
(3) 借助于EPRI诊断剂如某些自旋探针，对生物体内微环境极敏感的特性，可对癌症组织中不同区域氧分压、pH值或NO分布进行成像，分析生物体内某些理化特性的空间差别。可实现对癌症中氧浓度的无损空间定位及血液中的浓度分布，还可提供不同结构化合物在生物体内有效作用部位的区别。
(4) 进行药物代谢研究，通过观察自由基在体内的动态分布特性，可以得到有关药效、药代的重要信息。
在美国、英国等发达国家，电子顺磁共振成像(EPRI)正处于人体局部器官与组织以及全身检测的临床研究与开发阶段，随着电子顺磁共振技术、电脑软件数据处理技术以及稳定自由基EPRI诊断剂的快速发展，这一技术有望很快进入人体全身多种疾病的临床检测与诊断[11]。
3.5 电子顺磁共振成像诊断剂
生物体内顺磁性物质的含量通常低于毫摩尔水平，活体组织中内源性活性自由基浓度低、寿命短，更限制了通过电子顺磁共振成像(EPRI)对其直接成像的可能性。因此，EPRI必须依赖外源性稳定的顺磁性物质，如标记物、探针等引入生物体内来实现对生物体的成像。对生物体内自身顺磁性物质如NO自由基的EPRI，也要借助向生物体内引入自旋捕捉剂，从而形成加合物来实现成像。外源性顺磁性物质即电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂，一般为稳定的自由基，如异氮杂茚、咪唑啉、恶唑烷酮、哌啶、吡咯烷基类自由基[12-13]。
顺磁性化合物（如自由基）是一类具有广泛生物活性的物质，其结构特点是在有机分子的主体结构上（如哌啶、吡咯、咪唑、恶唑烷等）含有一个未耦电子。自由基是具有一个或多个不成对电子的原子或原子团化学物质，易与其它物质发生化学反应，其中4-羧酸-TEMPO(2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-氮-氧化物, TEMPO, 2, 2, 6, 6-tetrmethyl-1-piperidinoxy) 是一种已经商业化的氮氧自由基。
小鼠体内研究表明，吡咯烷基类自由基的稳定性是哌啶类自由基的2-28倍，但是其具有较宽的电子顺磁共振谱线。而异氮杂茚类自由基具有很好的生物稳定性与较窄的电子顺磁共振谱线，有望获得较高的成像分辨率与灵敏度，因此异氮杂茚氧化氮自由基，如5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基(CTMIO)比其它类自由基更有可能成为临床应用的EPRI诊断剂产品。从图3-1所示的电子顺磁共振谱线可看出，与4-羧酸-TEMPO相比，5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基(CTMIO)具有更为精细的第三电子顺磁共振谱线，可以有效提高EPRI诊断的分辨率与灵敏度[14-15]。
A 5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基
B 4-羧酸-TEMPO
图3-1 5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基和4-羧酸-TEMPO电子顺磁共振谱图
在目前EPRI诊断中，电子顺磁共振成像（EPRI）诊断剂引入体内的浓度须大于0.1mmol/kg, 才能获得有效的成像信号，而高浓度稳定自由基往往会对动物的生理或病理过程产生影响与干扰。小分子的稳定自由基，在体内代谢速度快，存留时间短，利用率低，并且不具有组织或器官选择性或靶向性，尤其对肿瘤的成像效果较差。因此，大分子肿瘤靶向性电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂将是EPRI研究与应用的重要发展方向[15]。
3.6 卟啉和金属卟啉化合物结构特点和功能特性
卟啉(Porphyrins)是卟吩(Porphine)外环带有取代基的同系物和衍生物的总称（如图3-2）。四个吡咯环和四个次甲基桥联起来的大π共轭体系，是平面型分香性。由于卟啉化合物具有平面结构的共轭性，电子缓冲性和光电磁性，同时还具有立体构型的多样性以及自组装等特性。因此，对卟啉类化合物进行功能分子的设计，赋予它许多特殊的性质，从而使卟啉化合物在光信息存储、分子识别、光导体、半导体、超导体、催化剂、抗癌药物、显色剂等方面都成为很有应用前途的功能材料。例如，在卟啉环周边进行化学修饰，引入特定官能团，使之与底物产生多重相互作用，可以达到对分子的精确识别。
图 3-2 卟啉类化合物的结构式
当卟啉化合物中的吡咯质子被金属离子取代后即为金属卟啉化合物，卟啉及金属卟啉化合物广泛存在于动植物中，对生命活动起着重要作用。叶绿素、血红素、维生素B12等都可以看作是金属卟啉类化合物，它们在生命过程中，对氧的传递(血红蛋白) 、贮存(肌红蛋白) 、活化(细胞色素P - 450)和光合作用(叶绿素)等起着十分重要的作用。
3.6.1 卟啉及金属卟啉类化合物在医学上的应用
血卟啉(hematoporphyrin)是从血液中提取的一种有机光敏物质，在生物体内，卟啉类化合物是作为血红素生物合成的中间体而存在的。卟啉化合物可作为有效光敏剂将肿瘤细胞再现于被吸收光谱的光波下，血卟啉衍生物(HPD)具有非常强的荧光效应，且易用一种特殊的维蓝排斥试验来表征，因此，可以用此效应作为组织中恶性肿瘤的诊断工具。1948年Figge等报道了血卟啉在癌症治疗中的一些应用。20世纪60年代，Lipson等研制的血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivatives, HPD)对恶性肿瘤的亲和性较强，在肿瘤组织中滞留时间较长，利用较小的剂量就可达到诊断和治疗的目的。
卟啉及金属卟啉类化合物因其结构具有特殊的性能，利用恶性肿瘤细胞对卟啉的亲和力明显高于正常细胞，卟啉类化合物能选择性聚集在肿瘤细胞内。因此，在医学研究中可作为检测癌症的光敏剂和抗癌药物。随着人们对卟啉类物质的不断深入研究，以卟啉类光敏剂为核心的光动力疗法也逐渐成为继手术、放疗和化疗之外的第四种成熟的癌症治疗方法。在治疗肿瘤方面具有效果明显、副作用小、创伤康复快等优点，目前该疗法已用于多种癌症的治疗。所谓光动力学疗法，就是利用能够滞留在病变组织（如癌细胞）中的特定光敏剂，在光的照射下产生单线态氧，摧毁病变组织，引起肿瘤细胞或非正常细胞的死亡而显示治疗作用。
3.6.2 卟啉类化合物在其它方面的应用
卟啉类化学物除了在生物医学领域上的应用外，随着卟啉和金属卟啉化合物合成的发展，它们在仿生化学、催化、太阳能利用、特种材料、分析化学、地球化学等方面有着越来越重要的作用和应用。
3.6.3 金属卟啉化合物作为磁共振成像造影剂的研究
锰卟啉等水溶性的金属卟啉化合物对肿瘤具有较好的亲和性，可以被肿瘤组织选择性摄取，因此金属卟啉化合物可以用作为肿瘤选择性的基团[16-18]。金属-卟啉配合物能快速地从血液中清除并累积于肝、肾和肿瘤组织中。Young等研制了许多Mn-卟啉配合物的肿瘤靶向性磁共振成像造影剂。国内外许多学者合成了一系列水溶性金属卟啉肿瘤靶向造影剂，并研究了造影剂的体外弛豫率和在肿瘤细胞中的富集过程(图3-3)。动物实验结果表明，水溶性的5, 10, 15, 20-四对苯磺酸基卟啉(meso-tertrasulfonatophenyl porphyrin, TPPS)可累积于Walker癌肉瘤组织中；Meso-tertra[4-(carboxymethyleneoxy) phenyl] porphyrin (H2T4CPP)能富积于Swiss小鼠体内的Sarcoma 180腹水癌和Sprague-Dawley大鼠体内的乳腺癌组织中。因此TPPS、H2T4CPP与TMPyP的Gd (III)、Mn(II)配合物已用于肿瘤靶向磁共振成像造影剂[19-20]。
图3-3 金属-卟啉配合物的结构式
具有超大环结构的卟啉衍生物Texaphyrins，如Bistriethyleneglycol gadolinium texaphyrin diacetate (PCI-0120 Gd3+) Ga-dophrin-2 [mesoporphyrin-IX-13, 17- bis[2-oxo-4, 7, 10, 10-tetra(carboxylatomethyl)-1, 4, 7, 10-tetraazadecyl]-diamide, digadolinium complex, disodium salt]也被研究作为肿瘤靶向性磁共振成像造影（图3-4）。这类造影剂的钆离子含有较多的配位水分子（4~5个），具有较高的弛豫率，在注射给药3-24小时后，能累积于体内肿瘤组织中，实现靶向成像，明显提高成像对比度和清晰度，造影效果好，能检测微小的肿瘤病灶，十分有利于肿瘤的早期诊断。Wiener等利用肿瘤能选择摄取叶酸的特性，合成了含叶酸基团的造影剂，实验证明这类造影剂对肿瘤具有较好的靶向性。另外，Wienmann等也合成了对肿瘤细胞具有高亲合性的造影剂[21-24]。
利用卟啉衍生物对肿瘤具有特异亲和性的特点，TPPS、血卟啉等衍生物还被作为介质广泛应用于肿瘤细胞的光动力学治疗和声动力学治疗中，这种高效、无创伤的癌症疗法已逐渐引起人们的注意[25-27]。
虽然卟啉衍生物作为对肿瘤组织靶向的化合物已广泛用于癌症的检测、诊断与治疗，以及其它与肿瘤相关的科学研究与应用中，但是其能被肿瘤组织特异性摄取的机理并没有被揭示。有的学者认为，肿瘤细胞中含有大量低密度的脂蛋白(low-density lipoproteins, LDL)受体，而卟啉易与体内低密度脂蛋白相结合。通过低密度脂蛋白与蛋白受体特异性亲和作用，肿瘤细胞受体介导内吞低密度脂蛋白衍生物来选择性摄取卟啉。因此，卟啉衍生物对肿瘤组织靶向机理有待进一步的研究[19-20]。
图3-4 金属-Texaphyrins配合物和PCI-0120 Gd(Ⅲ)的结构式
3.7 具体研究内容为：
本论文拟研制稳定、低毒、对肿瘤具有靶向性的卟啉-异氮杂茚自由基型电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂，探讨诊断剂对肝癌靶向EPRI造影性能与靶向机理。
(1) 设计合成水溶性的5-对苯氨基-10, 15, 20-三对苯磺酸基卟啉与聚天冬酰胺可生物降解型高分子，并进行结构表征与性能研究。
(2) 将5-对苯氨基-10, 15, 20-三对苯磺酸基卟啉衍生物和稳定5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基(CTMIO)通过化学反应引入聚天冬酰胺的侧链，从而制备水溶性聚天冬酰胺衍生物肿瘤靶向性EPRI诊断剂，并对所合成的诊断剂进行结构表征。
(3) 以实验老鼠体内肝癌为动物模型，深入研究靶向性EPRI诊断剂的稳定性、水溶性、毒性、电子顺磁共振性能和成像造影性能，以及影响这些性能的主要因素（如诊断剂的化学结构，靶向基团），进一步探讨诊断剂在老鼠体内分布以及靶向机理。总结出对肿瘤靶向性诊断剂的设计与合成具有指导性的规律。
(4) 在肝癌培养过程中跟踪进行EPRI成像，对肝癌致病因子进行无损检测分析，揭示癌症发生与发展规律。
第 4 章
4.1 前言
当前治愈癌症的关键在于临床上早期发现、早期诊断、早期治疗，即是否能较早的发现微小病灶，并进行及时有效的治疗。随着生命科学、电子学、计算机与图像科学的进一步发展与结合,会推动生物体内的EPR及EPRI技术的快速发展，EPRI即将成为一种广泛应用于癌症临床早期诊断的先进影像检测技术。并且，EPRI与MRI相辅相成，为研究生物体内活性自由基的功能及机理方面提供重要线索，为从空间整体角度揭示诸如癌变、衰老和其它病变等发生发展过程，以及自由基等顺磁性物质所起的作用，提供可靠科学依据[33-34]。
在以前研究工作的基础上，跟踪国际研究发展的前沿，针对我国癌症发病率高的特点，本文将选用卟啉衍生物作为肿瘤靶向性基团，拟研制靶向性卟啉-异氮杂茚自由基电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂。本文研制的水溶性肿瘤靶向性电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂，以水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子用作肿瘤靶向EPRI诊断剂的载体，卟啉作为靶向基团，异氮杂茚自由基作为造影剂。其具有良好的EPRI造影性能和肿瘤靶向性能，能主动聚集在肿瘤部位，并在肿瘤组织与细胞内持续时间较长，从而实现靶向成像，提高成像对比度和清晰度，造影效果好，从而极大提高药物的生物利用率，有效降低药物的毒副作用和用药剂量。
聚天冬酰胺如α, β-聚(2-羟乙基)-L-天冬酰胺和α, β-聚(2-胺乙基)-L-天冬酰胺等，都是可生物降解的水溶性高分子。这类高分子可通过侧基结构的设计与组合，来调节材料降解的速度、控制药物释放的速率、材料的力学性能等，而且还可以通过侧基化学反应来达到生物功能化和生物智能化目的。聚天冬酰胺及其衍生物由于具有良好的性能在生物医药领域已得到广泛的应用。本文拟设计合成水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子用作肿瘤靶向EPRI诊断剂的载体。具体合成路线如下：
Scheme 4-1 Synthetic route of EPR Imaging Contrast Agent with target groups of porphyrin
4.2 实验部分
4.2.1 试剂和仪器
N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，二氯甲烷，吡咯，对硝基苯甲醛，均为分析纯试剂，用前经氢化钙(CaH2)无水处理后重蒸得到。丁基理，钨酸钠，均为上海国药集团试剂。甲苯，无水乙醚，四氢呋喃用前均经钠砂干燥，并在氮气气氛下蒸馏得到。
FT-IR用TJ270红外光谱仪测定，KBr压片。UV用北京谱析紫外光谱仪测定。1H NMR用Varian Mercury VX-300型核磁共振波谱仪于300MHz下测定，DMSO为溶剂，TMS为内标。热分析用NETZSCH-DSC 200F3型测定，升温速率为10K/min。
4.2.2 5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl的合成
4.2.2.1 N-Benzylphthalimide的合成
将邻苯二甲酸酐(107g, 0.722mol)、苄胺(120mL, 1.10mol, 1.52equiv.)和冰乙酸(500mL)加入烧瓶中，回流反应3小时后，热的反应液在搅拌条件下，倒入冰水混合物中(1.5L)，得到白色粗产品N-Benzylphthalimide。粗产品用乙醇进行重结晶，得到白色针状的固体物质(168.9, 98.5%), mp 116-118℃(lit., 116℃)。反应方程式Scheme 5-2
Scheme 4-2 N-Benzylphthalimide was synthesis according to the method of lit 300
4.2.2.2 2-Benzyl-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline 的合成
将干燥的镁粉(40g, 4.94mol, 1.17equiv.)和几粒I2 加入干燥的圆底烧瓶中，并通过抽真空、通氮气的条件下，排除反应装置中的空气。加入无水乙醚(130mL)和少量的碘甲烷(5mL)，待反应中无水乙醚的回流消失后，再滴加剩下的碘甲烷(50mL, 150g, 0.8mol, 1.9equiv.)和无水乙醚(350mL)。滴加完毕后，继续反应2h后，升高反应温度并回收无水乙醚，带反应温度达到80℃，停止反应，得到格式试剂。
待上述格式试剂冷却到64℃后，将N-Benzylphthalimide(33g，0.14mol)无水甲苯溶液(250mL)滴加到格式试剂中，并将反应温度维持在64℃。滴加完毕后，升高反应温度并回收溶剂，当温度达到110℃时，停止回收溶剂。继续反应3h后，再回收剩下的溶剂。
待反应液冷却到室温后，加入无水正己烷(500mL)，抽滤得到滤液，得到2-Benzyl-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline 晶体(9.7g, 27%)。将所得粗产品，在甲醇中进行重结晶，得到无色2-Benzyl-1,1,3, 3-tetramethylisoindoline晶体(7.8g, 21%), mp 61-62℃ (lit., 63-64℃)反应方程式Scheme5-3
Scheme 4-3 Synthetic route of 2-Benzyl-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline
4.2.2.3 5-Bromo-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline合成
将2-Benzyl-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline (5.0g, 18.9mmol)溶解在干燥的二氯甲烷(60mL)中，并通氮气保护。在冰浴条件下，滴加液溴(2.15mL, 420mmol, 2.2 equive.)的二氯甲烷(40mL)溶液，滴加完毕后，加入无水氯化铝(9.0g, 3.5equiv.)。在冰浴条件下继续反应1h后，将反应液倒入冰(150mL)中，加入氢氧化钠(10M)溶液至pH=14，用二氯甲烷萃取三次(70mL×3)。所得有机相用氯化钠溶液水洗三次后，减压浓缩得到金黄色油状物。
在上述油状物中，加入甲醇(30mL)和碳酸氢钠(200mg)后，缓慢滴加双氧水(30%)直至反应液不在变浑浊。向反应液中加入硫酸(2.0M; 75mL)溶液后，并用二氯甲烷洗两次(2×50mL)，除去苯甲醛。在冰浴条件下，向所得水相加入氢氧化钠水溶液(10M)至pH=14，用二氯甲烷萃取三次(3×70mL)。将收集到的有机相，用氯化钠水溶液水洗三次，并用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到金黄色晶体(4.295g, 90%)。反应方程式Scheme 5-4
Scheme 4-4 Synthetic route of 5-Bromo-1,1,3,3-tetramethylisoindoline
4.2.2.4 (5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl)的合成
将5-Bromo-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoline (4.295g, 16.9mmol)溶解于干燥四氢呋喃(48mL)中，在-78℃条件下（干冰丙酮溶液），加入丁基锂(1.6M; 23.4mL, 2.2 equiv）。反应10min后，将反应液倒入干冰的四氢呋喃溶液中(200mL)，继续反应至反应液温度为室温时，停止反应并浓缩得到粗产品。将粗产品用盐酸(2M; 50mL)溶解后，用二氯甲烷洗三次(3×50mL)。收集得到的水相，用碳酸钠中和至中性，再用二氯甲烷洗三次(3×50mL)，浓缩得到油状粗产品。
将上述粗产品溶解在水/甲醇(40mL/35mL)混合溶液中，加入碳酸氢钠(1.14g, 13.6mmol, 0.8equiv.)、钨酸钠(500mg, 1.5mmol, 0.09 equiv.)和双氧水(30%; 10.0mL, 5.2equiv.)。室温下搅拌反应24h后，加入双氧水(30%; 2.0mL, 1.04equiv.)。在室温条件下，继续搅拌反应48h后，向反应液中加入氢氧化钠溶液(10M)，并用二氯甲烷萃取三次(3×70mL)，除去有机物。将收集得到的水相，用盐酸中和至中性后，二氯甲烷萃取三次(3×70mL)。收集得到的有机相，用氯化钠水溶液水洗三次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基(5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl)。以三氯甲烷为淋洗剂，将粗产品通过柱层析提纯，并在乙腈中进行重结晶，得到绿色晶体(1.69g, 43%)。mp 214-218 °C (decomp.)。
Scheme 4-5 Synthetic route of 5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl
4.2.2.5 5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl N-hydroxysuccinimidylester的合成
将5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基(100mg, 427umol)、SuOH(54mg, 470mmol, 1.1equiv.)溶解于二氯甲烷中(4mL)，在冰浴条件下，加入DCC(92mg, 446umol, 1.05equiv.)反应3h，抽滤并浓缩得到粗产品。以三氯甲烷为淋洗剂，将粗产品用柱层析提纯，得到绿色固体(95mg, 67%)。反应方程式Scheme 5-6
Scheme 4-6 Synthetic route of 5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl-N-hydroxysuccinimidylester
4.2.3 靶向性水溶性磺酸基氨基卟啉的合成
4.2.3.1 5-(4-硝基苯)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成
Scheme 4-7 Synthetic route of 5-(4-Nitrophenyl)-10,15,20-Tris(4-sulfonatophenyl)porphyrin，Trisodium salt
将4-硝基苯甲醛(0.59g, 3.9mmol, 1equiv)，苯甲醛(1.13mL, 11.1mmol, 3 equiv)和吡咯(1.04, 15mmol, 4 equiv)加入无水二氯甲烷中(1000mL)。在氮气的保护条件下，室温反应15min后，加入三氟化硼乙基醚(0.4mL)。继续搅拌反应1h，加入DDQ(2.6g, 15mmol)，反应1h后停止反应，减压浓缩得到粗产品。通过柱层析法进行分离（淋洗剂：正己烷/二氯甲烷=1: 1），收集第二带产品(0.52g, 20%)。
4.2.3.2 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成
在氮气保护条件下，将5-(4-硝基苯)-10, 15, 20-三苯基卟啉(0.26g, 0.39mmol)溶解于浓盐酸中(10mL)，加入二氯化锡(0.28g, 1.2mmol)，反应液在65℃下反应4h。反应溶液冷却后，倒入30mL蒸馏水中，并加入浓氨水至pH=8。将水相用三氯甲烷萃取，得到的有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品。通过柱层析法进行提纯，淋洗剂为二氯甲烷，得到5-(4-氨苯基)-10，15，20-三苯基卟啉(0.22g, 88%)。
4.2.3.3 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉
将5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉(0.04g, 47umol)溶解于浓硫酸中(10mL)，反应液在70℃条件下反应4天后，反应温度降至室温，继续反应3天。反应液倒入蒸馏水中(10mL)，并加入氢氧化钠水溶液(2M)至pH=10，得到5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉(0.037g, 68%)。
4.2.4 聚丁二酰亚胺(Polysuccinimide, PSI)生物载体的合成
研细的L-天冬酰胺(50g, 0.373mol)，磷酸(85%, 25g)置于2L的烧瓶中混合均匀。在180℃条件下，减压反应2.5h，除去反应体系中的原有水以及反应生成的水。待冷却后，加入DMF(20mL)溶解反应物，将溶液倒入蒸馏水中(1L)，进行重沉淀。抽滤得到的沉淀物经水洗至中性，在100℃下真空干燥，得到白色固体(35g, 96%)。反应方程式Scheme 5-8, FT-IR (KBr, cm-1)：3610-3450 (-NH, -OH), 2929 (C-H), 1791, 1761 (-CO-N-OC-), 1394 (C-N)。
Scheme 4-8 Synthetic route of Polysuccinimide, PSI
4.2.5 水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子用作肿瘤靶向EPRI诊断剂的制备
4.2.5.1 PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉的合成
配制两份聚丁二酰亚胺(0.097g, 1mmol)溶于DMF(1mL)的溶液，快速搅拌下分别缓慢滴加占聚丁二酰亚胺单元摩尔数10%、20%的5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉(0.0935g, 0.1mmol)和(0.187g, 0.2mmol)，反应液在65℃条件下搅拌反应48h。
将上述反应液冷却到0℃，分别缓慢滴加乙醇胺(0.18mL, 3mmol)，继续反应24h后停止反应。反应液用无水乙醚和无水甲醇混合液(V/V=1:1)进行沉淀，将所得产品置于透析袋中，透析24h，除去未参与反应的5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉和乙醇胺，减压浓缩得到PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉(10%)和PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉(20%)两种水溶性高分子。水溶性高分子侧链中5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉和乙醇胺摩尔组成比如Table 所示
4.2.5.2 PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基的合成
将PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉(60.51mg, 0.3mmol)溶于DMF(30mL)的溶液，分别加入占PHEA单元摩尔数40%、70%、100%的5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基活性酯，在室温条件下搅拌48h。将反应液倒入无水乙醚和无水甲醇混合液(150mL , V/V=1:1)中进行重沉淀，过滤得到固体。所得固体溶于蒸馏水中，并置于透析袋中，透析24h除去未反应的5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基活性酯，减压浓缩得到PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基。
4.2.6 PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基与FeCl3的络合反应
将PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-羧酸-异氮杂茚氧化氮自由基(10.6mg, 0.025mmol)溶于去离子水(10mL)中，反应液温度保持在70℃下，加入FeCl3(16.25mg, 0.1mmol)，用NaHCO3饱和溶液将反应液的pH调到6.0，反应过程中始终保持pH在6.0以上，加热反应0.5h后，再加入FeCl3(3.25mg, 0.02mmol)，继续反应，利用UV检测反应的进程。
4.3 结果与讨论
4.3.1 结构表征
4.3.1.1 水溶性磺酸基卟啉
以对硝基苯甲醛、吡咯、苯甲醛为原料，按照文献分别合成了5-(4-硝基苯)-10, 15, 20-三苯基卟啉、5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉、5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉。经1H NMR、UV等进行结构表征，分析如下：
4.3.1.2 5-（4-硝基苯）-10, 15, 20-三苯基卟啉
1H NMR (CDCl3, d, ppm): 8.95-8.83 (C20H8N4H2), 8.22 (m, C6H4, 6H), 8.0 (d, C6H4-NO2, 2H), 7.76 (m, C6H4, 9H), 7.06 (d, C6H4-NO2, 2H), -2.79 (s, NH, 2H)。
UV (CH2Cl2, nm): 418, 515, 547, 590, 645。
4.3.1.3 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉
1H NMR (CDCl3, d, ppm): 8.95-8.83 (C20H8N4H2), 8.22 (m, C6H4, 6H), 8.0 (d, C6H4-NH2, 2H), 7.76 (m, C6H4, 9H), 7.06 (d, C6H4-NH2, 2H), -2.79 (s, NH, 2H)。
UV (CH2Cl2, nm): 419, 516, 553, 591, 647。
4.3.1.4 5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉
1H NMR (CDCl3, d, ppm): 9.04-8.82 (C20H8N4H2), 8.18(m, C6H4-SO3Na, 6H), 8.06 (d, C6H4-NO2, 2H), 7.99 (m, C6H4, 9H), 7.06 (d, C6H4-NO2, 2H), 5.06 (s, NH2, 2H), -2.79 (s, NH, 2H)。
UV(H2O, nm): 415, 513, 551, 590, 647。
Figure 4-1 1H NMR speetrum of the 5-(4-Nitrophenyl)-10,15,20-Trisphenyl porphyrin
Figure 4-2 1H NMR speetrum of the 5-(4-Amionphenyl)-10,15,20-Trisphenyl porphyrin
Figure 4-3 1H NMR spetrum of the 5-(4-Amionphenyl)-10,15,20-Tris(4-sulfonatophenyl) porphyrin
4.3.1.5 5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl
以邻苯二甲酸酐为原料，按照文献经多步反应合成了5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl。自由基经FT-IR、质谱进行结构表征，表明所得产品属目标产物。分析如下： FT-IR (KBr, cm-1): 3477-3417 (OH), 2982 (CH), 1715 (CO), 1617 and 1585 (C-C), 1392 and 1367 (NO), 1219 (C-O); m/z =234。
Figure 4-4 FT-IR spectrum of the 5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl
Figure 4-5 Mass spectrum of the 5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl
4.3.1.6 水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子衍生物
肿瘤靶向EPRI诊断剂是以水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子作为载体，采用5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉与乙醇胺，按不同比例（摩尔）先后对聚丁二酰亚胺开环得到。分别合成了5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉与聚丁二酰亚胺(PSI)投料比（摩尔）为10: 1、5: 1的两种水溶性高分子。高分子易溶于水、DMF、DMSO等溶剂，经1H NMR、FT-IR、UV结构表征，分析如下: 1H NMR (DMSO, d, ppm): 8.87 (=CH-CH=), 8.22, 8.08 (C6H4-SO3Na), 7.95, 7.38 (C6H4-NH-), 3.47 (-CH2-CH2-OH), 3.13 (-CH2-CH2-OH), -2.92 (=C-NH-C=)。
FT-IR (KBr, cm-1): 3385 (-OH), 2929 (C-H), 1655, 1539 (-OC-NH-), 1102 (-CH2-CH2-OH); UV (H2O, nm): 333, 415, 520, 560, 597, 650。
红外光谱结果表明，在1712cm-1, 1394cm-1处出现的吸收峰为聚丁二酰亚胺两个相邻羰基偶合作用产生的，说明聚合产物具有酰亚胺的结构；水溶性聚天冬酰胺高分子在1655cm-1, 1539cm-1出现的酰胺Ⅰ谱带、Ⅱ谱带特征吸收峰，以及1712cm-1处吸收峰的消失，说明聚丁二酰亚胺开环形成酰胺；1012cm-1处出现的吸收峰归属于乙醇胺中的亚甲基(-CH2-CH2-OH)，说明透析过的水溶性聚天冬酰胺高分子侧链中键接了乙醇胺。
紫外光谱结果表明，透析得到的水溶性高分子在415nm, 520nm, 560nm, 597nm, 650nm处出现的吸收峰为卟啉环的特征吸收峰，333nm处出现的吸收峰为卟啉分子中所含苯基特征吸收峰，说明聚丁二酰亚胺高分子被卟啉开环，在其侧链中键接了5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉。
Figure 4-6 UV spectrum of the PHEA- Prophrin
1H NMR图谱结果分析：-2.92ppm属于卟啉环的-N-H, 4.55ppm属于聚天冬酰胺片段中的-NH-OC-CH-CH2-。根据高分子中卟啉环的-N-H和聚天冬酰胺片段中的-NH-OC-CH-CH2-在1H NMR谱图中的积分面积，可以计算出聚天冬酰胺高分子侧链中所含的卟啉结构片段与聚天冬酰胺结构片段的组成比(Table 4-1)
Table 4-1 Repeat unit Prophrin/ Ethanolamine in polymer
Sample Feed molar ration Molar ration of Molar ration of
of Prophrin Ethanolamine
Prophrin/PSI in polymer in polymer
PHEA- Prophrin (10%) 0.1:1 0.0154:1 0.9846:1
PHEA- Prophrin (20%) 0.2:1 0.0966:1 0.9034:1
结合1H NMR图谱、红外光谱和紫外光谱结果表明，可以确认可水溶性聚天冬酰胺可生物降解高分子的侧链上键接了靶向性基团(5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉)和乙醇胺。
Figure 4-7 1H NMR speetrum of the PHEA- Prophrin
Figure 4-8 FT-IR spectrum of the PSI
Figure 4-9 FT-IR spectrum of the PHEA- Prophrin (10%)
Figure 4-10 FT-IR spectrum of the PHEA- Prophrin (20%)
4.3.1.7 肿瘤靶向性电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂
采用水溶性聚天冬酰胺(PHEA- Prophrin)高分子衍生物与活性酯(Suo-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl)反应，制备肿瘤靶向性电子顺磁共振成像诊断剂(PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15，20-三磺酸钠苯基卟啉-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl)。所得化合物经1H NMR、FT-IR、DSC等进行结构表征。
Suo-5-Carboxy-1,1,3,3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl
FT-IR (KBr, cm-1): 3445 (-OH ), 2978 (-CH), 1772 (-CO-N-OC-), 1742 (-COO-), 1619 (C-C), 1425(-CO-N-OC-), 1360(-N-O), 1200(C-O)。
核磁图谱结果表明，1.37ppm、1.70ppm处的峰归属于PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl侧链所含自由基中的甲基吸收峰，这表明通过酯化反应，已成功将自由基(5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl)接入水溶性聚天冬酰胺衍生物的侧链中，制备了肿瘤靶向性电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂。
Figure 4-11 1H NMR speetrum of the PHEA- Prophrin-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl
对肿瘤靶向性电子顺磁共振成像(EPRI)诊断剂进行热力学性能分析，结果见Table 4-2
Table 4-2
Sample Glass transition Sample Glass transition
Temperature（Tg，℃） Temperature（Tg，℃）
PSI 301.3 - -
PHEA- Prophrin（10%） 232.9 PHEA- Prophrin（20%） 238.1
PHEA- Prophrin（10%） 236.6 PHEA- Prophrin（20%） 246.5
-自由基（40%） -自由基（40%）
PHEA- Prophrin（10%） 249.5 PHEA- Prophrin（20%） 251.4
-自由基（70%） -自由基（70%）
PHEA- Prophrin（10%） 262 PHEA- Prophrin（20%） 263.8
-自由基（100%） -自由基（100%）
由Table可知，聚丁二酰亚胺(PSI)的玻璃化转变温度为301.3℃，在5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉和乙醇胺作用下氨解，生成聚天冬酰胺衍生物(PHEA-Prophrin)玻璃化转变温度降至232.9℃、238.1℃。这是由于PSI主链为内酰胺的环状结构，氨解后主链的刚性降低，导致PHEA-Prophrin的玻璃化转变温度降低；而PHEA-Prophrin(20%)的玻璃化转变温度高于PHEA-Prophrin(10%)，这是由于卟啉分子刚性比乙醇胺高，故PHEA-Prophrin的玻璃化转变温度随着侧链中所含卟啉结构单元的增加而升高。同时PHEA-Prophrin-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl的玻璃化转变温度随着自由基含量的增加而升高，这可能是以为侧链刚性基团的引入导致玻璃化转变温度的升高。
Figure 4-12 FT-IR spectrum of the PHEA- Prophrin-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxy
Figure 4-13 FT-IR spectrum of the PHEA- Prophrin-Fe-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxy
采用PHEA-5-(4-氨苯基)-10, 15, 20-三磺酸钠苯基卟啉-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl 与FeCl3的络合，制备了侧链含金属卟啉配合物的聚天冬酰胺衍生物。由红外图谱可知，形成金属卟啉配合物后，酰胺Ⅱ谱带由1541 cm-1蓝移至1455 cm-1，以及在1732cm-1出现的吸收峰属于羰基(-COOCH2-)的吸收峰，这表明在配合时，铁离子也配合到酰胺键上，使酰胺键的吸收峰强度降低，酯键中的羰基吸收峰得以显现，从而也表明稳定自由基以酯键的形式接枝到聚天冬酰胺衍生物的侧链上。
卟啉配体中N-H弯曲振动吸收峰在964cm-1处，形成配合物后，此吸收谱带消失；紫外光谱中，金属离子与化合物配合后，Soret带与Q带都发生了变化，与配合前相比，Soret带蓝移至415nm，Q带吸收峰个数减少为三个。由红外光谱和紫外光谱可知，金属卟啉配合物说明金属离子已嵌入卟啉环，取代了卟啉环内的两个吡咯质子生成了配合。
Figure 4-14 UV spectrum of the PHEA- Prophrin-Fe-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl
4.3.1.8 聚天冬酰胺衍生物载体的细胞毒性评价
将HeLa细胞培养在含10％新生牛血清的RPMI 1640 培养液（含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素）中，并放置于37℃恒温环境，体积分数为0.05的CO2孵箱中生长。取处于对数生长期的HeLa细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化液消化，并以每孔1.0×104 个细胞接种于96孔板，每孔体积为100uL。将培养板移入37℃，体积分数为0.05的CO2的孵箱中培养24h，除去培养液，用PBS溶液洗两次。实验组每孔入不同浓度的PHEA-Prophrin(10%)-异氮杂茚氧化氮自由基(100%)、PHEA-Prophrin(10%)-异氮杂茚氧化氮自由基(100%)、异氮杂茚氧化氮自由基的无血清培液100 u L，对照组加入等体积的培养基，在37℃恒温环境，体积分数为0.05的CO2的条件下，培养24h后中断培养，除去上清液，用PBS溶液洗两次，每孔加入80 uL无血清培液和20 uL 5g/L MTT溶液，37℃反应4h。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 uL二甲亚砜，室温温育30min。轻轻振动后通过酶标仪测定各孔在570nm处的吸光度值。细胞生长的抑制率通过公式计算：抑制率=1-实验组吸光度值/对照组吸光度值。
Figure In vitro cytotoxicity of 5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl against HeLa cell line
Figure In vitro cytotoxicity of PHEA-Prophrin(10%)-5-Carboxy-1, 1, 3, 3-tetramethylisoindoin-2-yloxyl (70%) against HeLa cell line
细胞毒性实验结果表明，对于HeLa细胞，异氮杂茚氧化氮自由基、PHEA-Prophrin(10%)-异氮杂茚氧化氮自由基(70%)和PHEA-Prophrin(10%)-异氮杂茚氧化氮自由基(100%)均表现出较低的细胞毒性。从图中可以看出，细胞生长抑制率随浓度的增加而增加，在低浓度范围时，反而对HeLa细胞的生长甚至有促进作用；当浓度增加到1mg/mL时，细胞的生长抑制率分别为9.98%、0.68%、17.84%。PHEA-Prophrin(10%)-异氮杂茚氧化氮自由基(100%)表现出比异氮杂茚氧化氮自由基和PHEA-Prophrin(10%)-异氮杂茚氧化氮自由基(70%)更高的细胞毒性，这可能是因为卟啉对肿瘤细胞具有靶向性，使PHEA-Prophrin(10%)-异氮杂茚氧化氮自由基(100%)更易富集于肿瘤组织与细胞内，从而表现出对HeLa细胞的生长抑制率要高。
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